10多年来，艾滋病原学诊断技术迅速发展，主要包括HIV病毒分离、HIV病毒载量测定、HIV核酸检测，以及检测病毒抗原（p24抗原）和检测病毒特异性抗体。其中抗体检测方法是常规使用的HIV病原学诊断方法，其他方法主要用于特殊情况（“窗口期”、婴儿诊断、HIV抗体检测结果为不确定等—），或作为抗体检测方法的补充用作辅助诊断，或作为判断预后和指导治疗用药的依据（病毒载量的测定），一般不用作常规诊断。现将主要病原学诊断进展分述如下。
HIV抗体测定
检测抗-HIV抗体是艾滋病诊断的一项重要指标，也是控制HIV传播和控制艾滋病流行的重要手段。抗-HIV测定诊断要求准确、可靠，故必须经初筛试验和确认试验2个步骤。当前采用的初筛方法主要有：酶联免疫试验（ELISA）、明胶颗粒凝集试验（PA）、斑点印迹（层析或渗滤）试验和免疫荧光试验（IFA）。确认试验主要用免疫印迹试验（Westernblot,WB）。
检测抗-HIV的ELISA法是国际上应用最早、发展最快、至今在血源筛查中普遍使用的检测技术。为了保证输血安全，试剂的敏感性不断提高，窗口期显著缩短，使输血传播HIV的危险性大幅度下降。HIV经输血传播的危险从80年代的较高水平降至近年的1/440000~1/600000以下[1]。1985年美国研制成功第1代试剂（用病毒裂解抗原包被的ELISA间接法），虽然敏感性、特异性均较低，但在防止输血传播HIV上起到创始作用。为了避免细胞培养蛋白导致的非特异性反应，1990年，用基因重组和成肽抗原研制成第2代试剂。次年国际上又研制成双抗菌素原夹心法第3代试剂，灵敏度提高到99%以上，特异度>95%。第3代试剂不驻可检测抗-HIVIgG，而且可检测早期出现的IgM抗体，并在1996年改进成含有“O”亚型的第3代试剂。1998年，国际上已出现第4代试剂，在检测抗-HIV的同时也可检测p24抗原，称为HIV抗原/抗体试剂。第4代试剂目前主要有3种，分别是VironostikaHIVⅡ抗原/抗体、HIVCombi(Boehringer)和HIVDUO（Biomerieux）。正在我国注册的第4代试剂是荷兰生产的VironostikaHIVⅡ抗原/抗体，其抗原组分为gp160/gp36/NAT70，同时还包被了一个单克隆抗-p24抗体。
PA是一种快速的HIV血清抗检测方法。先将样品稀释，然后分别加入经抗原致敏的和未致敏的明胶颗粒，混匀后保湿（一般为室温）。由于操作简便，无需特殊仪器设备，很适合对少量标本的检测。当血清中有HIV抗体存在时，经抗原致敏的明胶颗粒与抗体发生抗原-抗体反应，根据明胶颗粒在孔中的凝集情况判读结果。目前已研制出HIV-1和HIV-2抗原共同致敏感的PA试剂（AFDHIV1/2PA）和HIV-1、HIV-2抗原分别致敏的PA试剂（AERODLA-HIV-1/2）。目前可用于HIV1/2的筛查，后者可用一区分HIV-1型和HIV-2型。
一般采用硝酸纤维素膜作固相载体，在载体下面有吸水衬垫可吸收加入的液体。将重组或多肽抗原包被在载体内，加入待检血清，包被抗原和被检血清中抗体结合，用胶体金（或胶体硒）代替底物连接在葡萄球菌蛋白A上，金标记蛋白A具有与人Ig结合的能力，因而可与被捕获的HIV抗体结合。若样品中有3~10min出结果，特异性较好，敏感性约相当于中度敏感的ELISA，对应急使用和农村偏远地区临床用血检测较为适宜，但不适于城市地区的献血员筛查。在农村偏远地区临床用血也必须进行HIV检测。目前在国内批准注册的有：Deter-minHIV1/2(ABBOTT)和InstantCHEK-HIV1+2(EY)2种金标（硒标）快速诊断试剂。
将HIV感染的淋巴细胞涂于玻片上，经固定后即为试验用抗原片，待检血清中的抗-HIV抗体与抗原结合后，再与荧光素标记的抗人Ig结合，在荧光显微镜下可见到含草绿色荧光的细胞和多核巨细胞（胞浆荧光）。目前国内仅在少数有条件和实验室使用。
美国布什政府已经批准了唾液快速检测艾滋病毒 (HIV) 法。这种前所未有的方法能够在 20 分钟内提供检测结果，准确率达到 99% 。而且未来唾液检测法制剂最终可能不需处方在药店出售，正如怀孕检测法一样。由于不需要接触血液 ,
唾液检测法还可保护医护人员避免感染。遗憾的是唾液检测法制剂昂贵,而且目前只能检测HIV-1，所以尚未获得中国进口批文.
应用聚合酶链反应(PCR)技术检测外周血淋巴细胞中HIV的前病毒DNA序列，或用逆转录-PCR（RT-PCR）法检测血浆中游离HIV的RNA。主要用于以下情况：（1）早期诊断围产期感染：（2）对HIV抗体免疫印迹试验的进一步做出诊断；（3）在HIV抗体未产生之前（“窗口期”）辅助诊断急性原发感染；为阻断“窗口期”HIV经血传播，有些发达国家已将HIVRNA的RT-PCR检测纳入血源检测；（4）区别HIV-1和HIV-2感染；（5）确定人群中HIV的变异；（6）监测临床药物治疗反应；（7）检测病毒的耐药性突变。
近年来随着分子生物学的飞速发展以及生物物理技术的大量应用，各种核酸扩增检测方法不断涌现。已经建立起来的方法HIV
RNA检测技术大体可两大类，靶核酸的直接扩增与信号放大扩增。前者包括聚合酶链式反应（PCR）、转录依赖扩增（TMA）和核酸序列扩增系统（NASBA）等，些方法都具有很高的灵敏度。信号放大扩增技术主要有支链DNA信号扩大系统（bDNA）。目前已获美国食品与药品管理局（FDA）认可临床使用的HIV-1核酸检测方法列于表1 ［2］
。这里对前三种应用最为广泛的HIV-1核酸检测方法予以介绍和评述。表1 获美国FDA许可临床使用的HIV-1核酸检测方法 ［2］
RT-PCR检测法 见图1。该检测是基于对HIV-1 靶核酸RNA逆转录（RT），然后对其产物cDNA进行PCR扩增 ［3］ 。如图2所示，采用既有逆转录活性又有DNA聚合酶活性的热稳定重组酶Thermus
thermophilusrTth）DNA聚合酶，使逆转录和PCR扩增一步完成。在包括对HIV-1gag基因保守区特异的寡核苷酸引物（生物素标记）、rTth聚合酶、三磷酸脱氧核苷的缓冲液中，病毒的cDNA片段通过加热冷却重复循环产生高拷贝数的扩增产物（Amplicon）。在包被HIV寡核苷酸探针的微孔板里，使Amplicons变性、杂交，加入抗生物素-辣根过氧化物酶（HRP）偶联物，与生物素标记的Amplicon结合，最后加入HRP底物比色测定结合
的Amplicon量。另外，该方法在样本提取RNA前加入一已知浓度的内标（IS），同时起着样本HIV-1RNA定量和补偿血浆中影响核酸提取和抑制扩增因子的作用。IS含有与Amplicon大小和引物结合区相同的体外转录RNA，它产生的Amplicon也结合在微孔板里，并用一酶联检测体系产生比色信号，使其与靶基因的Amplicon区分开。测定OD值，比较病毒核酸孔与QS孔的OD值，通过计算可定量病毒的拷贝数。
图1 RT-PCR检测方法原理示意图图2 NASBA扩增示意图 RT-PCR系统主要为Roche Diagnostic System生产的AMPLICOR HIV-1MONITOR Assay。
目前已推出的试剂有1.0版本和升级版本1.5版本。此试剂也有普通敏感方法和超敏感方法两种。该系统的优点在于（1）敏感:1.5版标准型检测范围200～3000000拷贝/ml，超敏感型20～75000拷贝/ml。（2）操作相对简单:一个工作人员手动操作可完成42份/天，若使用其全自动Cobas系统则可为轻松完成。（3）对大部分M组亚型有较好的敏感性。（4）对多数生物样品反应性良好。缺点在于（1）操作容易污染;（2）测定范围较小（相对于NASBA）;（3）部分生物样品反应受抑制，如精液、乳汁和唾液;（4）早期版本对部分亚型反应性较差，1.0版对非B亚型的样品反应性普遍较差;（5）对O亚
型检测能力较差。
NASBA检测法 NASBA扩增机制可以分为非循环和循环两个阶段 ［4］ 。它由三个酶在一个体系里连续反应，野生型HIV-1RNA与三种内标RNA同时扩增:反转录酶在一个5′端常有T 7 RNA聚合酶启动子序列的引物引导下，把目标RNA序列反转录成单链DNA，然后由Rnase
H把DNA/RNA杂合双链的RNA降解，再由反转录酶在另一引物引导下合成双链DNA。DNA可在T 7 RNA聚合酶的作用下，经其启动子序列起动而转录RNA。随着RNA的合成反应进入等温循环。RNA又可在反转录酶的作用下反转录成DNA。扩增后的产物使用NASBA
QR电化学发光（ECL）系统进行检测和定量，此系统包括亲和素标记的磁珠、生物素标记的核苷酸片段（此片段可与新合成的RNA产物的一端互补结合）及可特异与四种产物结合的探针（探针上标记有铷元素），这四种探针可分别与不同的RNA产物结合。将四种探针分别置于不同的反应管内，在适当的条件下（41℃）几种成分将结合在一起，形成复合体。这些复合体可在ECL读数仪中被分别读取其上铷元素的激发信号，根据野生型病毒核酸测定值与其他三个内标物测定值的比较可得到野生型病毒的拷贝数。该过程可用图2简单表示
［5］ 。
NASBA技术为Organon Teknika公司专利技术，早期产品为NASBA HIV-1RNA QT定量RNA测定方法，现已被最新版本的方法NucliSens HIV-RNA QT
Assay取代。方法也分为普通敏感度和超敏感度两种。该方法的优点是（1）测定范围大:40～10，000，000c/ml;（2）可对几乎所有生物样品进行检测;（3）敏感:最低检测限可达40拷贝/ml;（4）对各种抗凝剂均适用;（5）每个样品均有内部对照，可排除提取过程的误差。缺点在于:（1）早期版本（NASBA）对部分亚型（G亚型）反应性差。（2）操作复杂，样品提取（不使用自动提取仪时）和测定反
应时需要进行大量的手工操作。（3）不适合一次大量检测，ECL读数仪每次只能进行12个样品的检测。（4）实验内、外误差相对较大。
bDNA检测法 如图3所示，将HIV的RNA通过离心在蛋白酶K的作用下通过孵化从病毒颗粒中释放出来，然后用捕获探针1将其捕获到微孔中。用捕获探针2与病毒RNA的另一部分特异结合，又与预放大探针结合。后者再 与放大探针即bDNA探针杂交。两套靶探针分别与病毒 RNA的pol基因的不同区域特异结合。就在微孔中形成了HIV
RNA-寡核苷酸复合物。再加入一种化学发光底物孵育后产生化学发光信号，由于发光强度与样品中HIV RNA含量成正比，从而达到对HIV RNA的定量检测 ［6］ 。图3 bDNA方法示意图 本方法定量系统中没有内标记物，每次实验设置一系列外部标记，通过实验样品反应强度与外部标记样品强度的比较确定实验样品的病毒拷贝数。分支DNA（bDNA）原为Chiron
Diagnostics专利技术，现已被拜尔（BYER）公司合并。早期的试剂为Quantiplex HIV RNA2.0Assay，现已被Quantiplex HIV
RNA3.0Assay取代。该方法的优点是:（1）操作简便，尤其是在使用自动检测系统时。（2）适合大量样品的操作，3.0版可每次操作多达168份样品。（3）重复性好。（4）敏感性较好。缺点是:（1）对低值样品检测的特异性较差。（2）无内部质量控制，尤其在3.0版中为单孔检测时，无法控制由于提取或加样操作的失误。（3）不同版本间差异较大，2.0版约为RT-PCR的50%，3.0版结果与Roche基本相同表明两个版本间差异可能达到50%。（4）
对除血浆、血清外的大部分体液样品无法进行检测。（5）对 抗凝剂敏感，只能使用EDTA ［7］ 。
主要用于确认试验。WB是将HIV病毒蛋白用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）,把分子量大小不等的蛋白带分离开来，然后再把这些分离的不同蛋白带电转移到硝酸纤维素膜上。将此膜切割成条状，每一条硝酸纤维膜上均含有经电泳分离过的HIV病毒抗原。将待检血清样品用稀释液稀释成1：100，再把它直接加到硝酸纤维素膜上，恒温震荡，使其充分接触反应，血清中若含有抗-HIV抗体，就会与膜条上的带相结合。加入抗人-IgG酶结合物和底物后，即可使有反应的抗原-抗体结合带呈现紫褐色，根据出现条带情况判定结果。
结果判定标准
我国判定标准：
（1）HIV抗体阳性：至少2有条膜带（即gp160/gp120/gp41）和至少有1条膜带和p24（核心）带同时出现。
（2）HIV抗体阴性：无HIV抗体特异性带出现。
（3）HIV抗体可疑：出现HIV特异性抗体带，但带型不足以确认阳性者。
世界各国（或机构）对免疫印迹试验的结果判定标准并不完全一致。
美国传染病中心的判定标准是：
（1）HIV-1阳性[任两有其中2个条带（p24、gp41、gp120/160）]，HIV-2无阳性;
WHO的判定标准是：
HIV-1阳性（不管有无核心带或酶带，但有2条膜带），HIV-2阳性（不管有无核心带或酶带，但有2条膜带即为阳性）。
病毒载量测定是对感染或病人体内游离病毒核酸RNA含量的定量测定。通常使用血浆作为检测样品，根据不同要求改进的RNA提取技术使该试验也可使用多种体液和组织。目前使用的病毒载量测定技术主要有3种：RT-PCR、分支DNA信号扩大系统（bDNA）和核酸序列扩增系统（NASBA）。3种技术均由核酸提取、扩增或信号放大、定量检测3部分组成。
由于该方法敏感性和特异性高，在对感染早期及特殊免疫反应个体检测中具有重要意义，对判定临床进展情况、估计预后、疗效观察很有效，是制订和调整治疗方案的主要依据。
血浆HIVRNA水平测定的意义为：
（1）有急性HIV感染表现者：当HIV抗体试验阴性或不确定时有助于确定诊断；
（2）初诊断为HIV感染者：测定基本的病毒负荷量，以确定开始或推迟治疗；
（3）未接受治疗者：第3~4个月测定1次，以观察病毒负荷变化，选择开始治疗的时机；
（4）首次接受抗逆转录病毒治疗者：治疗4~8周后药效评估，决定续用或调整方案；（5）接受抗逆转录病毒治疗3~4个月者：观察治疗的最大效果，决定续用或调整方案；（6）长期接受抗转录病毒治疗者：每3~4个月测定1次，以观察疗效的特久性，决定续用或调整方案；
（7）CD4+细胞显著下降或有其他临床改变：确定与病毒负荷是否有关，决定开始治疗、续用或调整方案。
HIVRNA水平测定应避免在病人急性感染期（如细菌性肺炎、结核感染、卡氏肺孢子虫肺炎等）和免疫接种期进行，因此时（2-4周）血浆HIVRNA可升高。血浆HIVRNA的测定应在同一实验室同一方法进行，并在决定开始治疗或调整方案时重复验证。若本测定用于诊断HIV感染，则需有其他标准的方法验证。
通常采用夹心法EIA，即将纯化的已知抗体包被在固相反应板孔底，当加入待测血清后，若血清中含有p24抗原则与包被抗体形成抗原-抗体复合物，再加入酶（HRP）标记的HIV抗体，在抗原上又结合了酶标记的抗体，加底物显色后，在酶标仪上读结果。
近年来为了提高检测血清中p24抗原的敏感性，将血清中免疫复合物解离（ICD）后再进行测定，发展了ICDp24抗原测定试剂，用于HIVp24抗原测定。
常规方法是将病人淋巴细胞与正常人的淋巴细胞共同培养，适当周期培养后测定培养液HIVp24抗原/RT，进而判断病人的淋巴细胞是否受到HIV感染。
细胞培养与血清学方法相比，专一性很强，不会出现假阳性[4]。但其敏感性不如血清学或PCR，因为必须有一定数量的感染细胞存在才能培养出病毒来。细胞培养方法的最大好处是能得到最原始的临床毒种，其重要意义在于确认对WB不确定的疑感染者及母婴传播、婴幼儿HIV感染者。毒株可供药物筛选，耐药性及其生物学特性等研究。用定量细胞培养法可测定细胞的半数感染单位（TCID50）和英国数抑制药物浓度（IC50），用于抗病毒药物测定。本法一般不同于常规诊断。
化学发光免疫分析(chemiluminescence immunoassay,CLIA),是将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合，用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等的检测分析技术。是继放免分析、酶免分析、荧光免疫分析和时间分辨荧光免疫分析之后发展起来的一项最新免疫测定技术。
上世纪70年代中期Arakawe首先报道CLIA
，发展至今已经成为一种成熟的、先进的超微量活性物质检测技术，应用范围广泛，近10年发展迅猛，是目前发展和推广应用最快的免疫分析方法，也是目前最先进的标记免疫测定技术，灵敏度和精确度比酶免法、荧光法高几个数量级，可以完全替代放射免疫分析、彻底淘汰酶联免疫分析。主要具有灵敏度高、特异性强、试剂价格低廉、试剂稳定且有效期（6-18个月）、方法稳定快速、检测范围宽、操作简单自动化程度高等优点。高灵敏度的化学发光检测技术以被广大研究人员所认可，并正逐渐替代传统的生物检测技术。
化学发光与放射免疫法是公认的肿瘤标志物和各种激素最精确和最成熟的检测方法，二者的原理、技术与方法早已成熟并被国外各大医院用于肿瘤检测和激素检测，二者的试剂与仪器均通过美国FDA认证与我国药监局的批准。但是，放射免疫分析法虽有很高的灵敏度，却存在放射性防护和同位素污染的问题，况且试剂价格昂贵只有一个有保质期，在基层医疗机构难以普及。化学放光免疫分析仪继承了放射免疫的所有优点，同时克服了放射免疫和酶联免疫各自的缺点，是临床免疫检测最理想的新方法。可以肯定的说，她将取代放射免疫和酶联免疫成为临床免疫检测最理想的新技术。
1996年美国FDA首次批准HIV-1尿液ELISA试剂，我国也正在研制尿液HIV抗体检测试剂。主要适用于静脉注射毒品（IDUs）人群和其它高危人群的大面积流行病学调查、监测。筛查阳性者仍需采血做确认试验才能确定。
专家说法：
伦文辉：现在检测试剂有三种，一种是血液标准，一种是尿液标准，还可以用唾液标准。现在最常用的是血液标准，一个是酶联免疫法，还有一个是胶体金快速诊断法。这两种方法都是非常准确的，一般来讲，检测试剂的发展经历了四个阶段，就目前来讲，检测试剂和我们中国市场现在已经是第三代和第四代试剂，最早在两个礼拜就可以检测出HIV的抗体。尿液标准和唾液标准就是取材比较方便，对病人检测本身是没有损伤的。但是它的检测的灵敏度和特意性比血液标准稍差一些。(网友)：金标快速法和酶联免疫法，这两个方法哪个更可信？伦文辉：这两个都是可信的，只要有一种方法检测就可信
杨民：据我了解，目前我们国家三级以上的医院正常一般情况下使用试剂盒是第三代试剂盒，检测窗口期一般都可以知道，病人如果不知道医院的检测是不是具有权威性，可以问一下。全国艾滋病医院有一个职业培训或者职业要求，一个是要求艾滋病的初筛实验室，经过国家正规培训用的是同样试剂的话，结果应该是准确的。初筛实验室，北京市的疾病控制中心是北京市艾滋病的确认实验室，还有全国各地其它的省市防疫站、防疫部门，他们当地的艾滋病确认实验室。经过这些检测的话，如果超过一个月的话，检测基本都能查得出来。检测方法，一个是金标的方法，一个试剂盒做实验，一个多小时就能出报告，准确性在95％以上。酶标可能比它更稳定，酶标比金标准确率更高一些。
曹韵贞：他这个是他自己不知道中国已经有了尿液检测，是我在99年引进的，现在我们国家标准里就有了，尿液和血液一样如果一次是阳会拿血液再确认一次。唾液在美国也没有流行，也是刚刚开始，但是在中国也已经在开始商量和谈论这个问题。在全世界各地最普遍的还是血液检测，美国尿液也主要用在保险公司，我这不是贬低尿液检测，因为尿液检测的发明人是我，我不会贬低自己，我一回国就把它带回来了。相对是尿液比较方便，美国保险公司就是因为方便才这样做的，因为扎针需要得到允许，引进中国是因为像吸毒的和小孩扎针都比较困难，所以用尿比较方便。像云南河南cdc都已经开始了，和血液是一样的都需要确认，但是没有说尿液比血液更敏感这一说。
（以上编辑摘录自《中华检验医学杂志》2001年第24卷第3期）
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